Mikrobiotechnologija. Vartiklis

Spontaninę mikroflorą žmonės naudoja nuo seniausių laikų: raugti duoną, sūrį, alų, vyną, kopūstus ir t.t. Grynas mikroorganizmų kultūras išmokta auginti po Roberto Kocho atradimų.

Pramoniniai mikroorganizmai turi atitikti nemažai reikalavimų – turi nuolat sintetinti didelį kiekį produkto, greitai daugintis pigiose ir nesudėtingose terpėse, nesintetinti šalutinių produktų, kenkiančių gamybos technologijai (pvz., gleivės kenkia filtravimo ir džiovinimo intensyvumui) arba pačiam produktui (pašalinis skonis, kvapas, ...). Tinkami mikroorganizmai gaunami atrankos, mutagenezės, genų ir ląstelių inžinerijos metodais.

Atranka yra seniausias, bet tebenaudojamas metodas, panašus į augalų ir gyvūnų selekciją, tik naudojant specialią techniką. Plačiausiai naudojamas grynų kultūrų išgavimo iš vienos kolonijos metodas. Kolonija terpėje susidaro iš vienos ląstelės. Šiuo metodu išskiriami mikroorganizmai iš dirvos, gyvūnų virškinimo trakto, vandens ir kitų vietų. Gautas mėginys sėjamas į agrarizuotas terpes. Geriausia turėti tokią terpę, kurioje išaugusią koloniją galima lengvai atskirti nuo kitų, neaktyvių. Pvz., nugriebto pieno terpėje ląstelės, sintetinančios daug proteazių fermentų, aplink koloniją sudaro skaidrią zoną. Šio metodo trūkumas – neįmanoma tiksliai kiekybiškai nustatyti mikroorganizmų produktyvumo.

Mutagenezės metodas imtas taikyti tik 20 a. viduryje. Jis labai pravertė gaunant mikrobus – antibiotikų ir kai kurių aminorūgščių (lizino) producentus. Jie pavadinti superproducentais, o jų sintezė – supersinteze. Metodo privalumas tame, kad atranką galima daryti nieko nežinant apie reikiamo produkto biosintezę ir genetiką. Jos metu ląstelės paveikiamos fizikiniais arba cheminiais mutageniniais veiksniais. Fizikiniai veiksniai – tai rentgeno spinduliai, alfa ir beta dalelės, radioaktyvūs spinduliai, karštis ir šaltis. Cheminiai – nitrininė rūgštis, etilmetansulfanolas, sieros ipritas, alkaloidinės medžiagos (plačiausiai naudojama nitrozoguanidinas), kiti chemikalai.

Mutacijas sukeliantys mutagenai tiesiogiai arba netiesiogiai veikia DNR arba jų pirmtakus. Mutavusios ląstelės gali sintetinti labai didelius kurios nors medžiagos kiekius arba jų nesintetinti. Naudingų mutantų gavimui ląstelių populiacija dažniausiai paveikiama cheminiais mutagenais. Iš fizinių mutagenų paprastai taikomi ultravioletiniai (UV) spinduliai. Mutavusios ląstelės iš populiacijos išskiriamos grynų kultūrų išskyrimo metodais. Po ilgo ir kruopštaus darbo atrenkami pramoninę vertę turintys superproducentai.

Naujausias yra genų inžinerijos metodas. Jį 1972 m. pradėjo naudoti JAV mokslininkai S. Koenas¹⁾ ir H. Boeris²⁾. Atsirado galimybė konstruoti tokius superproducentus, kurių kitais metodais gauti nepavyksta. Taip sintetiniu būdu gaminamas feronas, insulinas, somatostatinas ir kitos medžiagos bei hormonai.

Tačiau genų inžinerija yra labai sudėtinga. Tam reikia daug žinių iš genetikos, nukleino rūgščių ir baltymų chemijos, enzimologijos, o taip pat mikrobiologijos žinių. Metodo esmė tokia: genas, kuris valdo norimo produkto biosintezę ląstelėje, įstatomas į plastidę arba fagų chromosomą (šie vadinami vektoriais). Gautoji rekombinantinė DNR molekulė perkeliama į kito mikrobo ląstelę. Visa ta procedūra vadinama klonavimu.

Yra įvairių genų gavimo metodų. Vienas jų – paveikti chromosomos DNR ta pačia restriktize kaip ir plazmidę. Gauti DNR gabalai (restriktai) turi komplementarius lipnius galus kaip ir perkirptos plazmidės. Sukarpytų plazmidžių mišinys sumaišomas su tokiu pat restriktų mišinio kiekiu. Judėdamos skystyje molekulės susiliečia ir lipnūs jų galai susijungia vandeniliniais ryšiais. Čia galimi du atvejai: a) plazmidės arba chromosomos (restriktai) susijungia tarpusavyje; b) chromosomos gabalai susijungia su plazmidės lipniais galais ir įsistato į ją. Vėliau chromosomos gabalai „susiuvami“. Tokia plazmidė jau turi svetimą geną. Vėliau plazmidė perkeliama į bakterijos ląstelę.

Ląstelių inžinerija - tai protoplastų suliejimo technika. Protoplastai gaunami ląstelės sienelę paveikus fermentais, kurie tirpdo mikrobų ląsteles. Gaunamos suapvalėjusios, gyvos, bet be sienelių mikrobų ląstelės-protoplastai. Veikiant juos polietilenglikoliu, protoplastai įgauna savybę susilieti. Susilieja ne tik tos pačios rūšies, bet ir skirtingų bakterijų rūšių protoplastai. Tokiu būdu įveikiamas tarpryšinio ląstelių kryžminimosi barjeras. Susiliejusios ląstelės turi abiejų ląstelių chromosomas. Tarp jų vyksta rekombinacija. Pasėjus susiliejusius ir nesusiliejusius protoplastus ant labai maistingos terpės paviršiaus, sužadinama ląstelių sienelės regeneracija. Susidaro ląstelių sienelės; ir protoplastai virsta bakterijomis. Iš regeneravusių bakterijų atrenkamos ląstelės su norimais požymiais.

Visi tie metodai leidžia pramoninę antibiotikų, aminorūgščių, pašarinių mielių, fermentų ir kitų mikrobinės kilmės produktų gamybą. Trumpai aptarsime kiekvieną grupę.

Antibiotikai - organinės medžiagos, žudančios mikroorganizmus arba stabdančios jų augimą. Aprašyta per 5000 antibiotikų, tačiau infekcinėms ligoms gydyti tinka tik per 50 antibiotikų. Daugiausia jų gaunama iš grybelių aktinomicinų. Pramoniniai antibiotikų gamintojai gauti mutagenezės būdu.

Insekticidai - bakterijų Bacillus thuringiensis ląstelių biomasė. Įvairių kamienų mikroorganizmai ląstelėje sintetina baltyminius kristalus ir kitas medžiagas, kurios specifiškai žudo atitinkamų vabzdžių lervas ir pačius vabzdžius. Žmonėms ir šiltakraujams gyvūnams šie preparatai nekenksmingi. Jų gamintojos – iš aplinkos išskirtos bakterijos.

Aminorūgštys. Svarbiausia maisto sudėtinė dalis yra baltymai, kurie yra sudaryti iš 20 aminorūgščių. Kol kas mikrobiologiniu būdu didesniais kiekiais gaminamos tik kelios aminorūgštys. Mitybos požiūriu svarbios 10 aminorūgštys, kurių žmonių ir gyvulių organizmas nesintetina – ypač lizinas, metioninas, treoninas ir triptofanas. Subalansavus pašarus pagal nepakeičiamas aminorūgštis, būtų sutaupoma daug pašarų ir pagaminama daugiau mėsos. O maisto pramonėje plačiai naudojama gliutamino rūgštis. Šie producentai gaunami mutagenės ir genų inžinerijos priemonėmis.

Fermentai - baltyminės kilmės katalizatoriai, dalyvaujantys ląstelių medžiagų apykaitos procesuose. Anksčiau jie gaminti iš augalų ir gyvūnų audinių ir palyginti mažai iš mikroorganizmų. Dabar pramoniniu būdu daugiausia fermentų gamina mikroorganizmai. Fermentais cukrinamas krakmolas, gydomos žaizdos ir nudegimai, skatinamas virškinimas, jie praverčia sulčių gamyboje, jie naudojami kaip analitinės medžiagos ir kt. Jų gamintojai gaunami atrankos iš aplinkos, mutagenezės bei genų inžinerijos metodais.

Hormonai - fiziologiškai aktyvios medžiagos, reguliuojančios organizmo funkcijas. Anksčiau jie gaminti tik iš gyvulinių audinių. Tačiau dabar genų inžinerijos metodais sukurti mikroorganizmų kamienai, gaminantys interferoną, insuliną ir kt. hormonus. Ypač svarbūs yra interferonai. Nuo 1970 m. jais imta gydyti virusines ligas. Anksčiau jie buvo išskiriami iš donorų kraujo, tad jų buvo pagaminama labai mažai. Tačiau vėliau jų poreikis labai padidėjo – ir paskaičiuota, kad norint jais aprūpinti 20 tūkst. pacientų, reikėtų visų Žemės gyventojų kraujo. Tokį poreikį patenkinti tegali tik mikrobiologinė technologija.
Insulinu gydomi sergantys diabetu, kuris užima 3 vietą po širdies-kraujagyslių ir vėžio ligų.

Trečioji gyvybės būsena

Mokslininkai paskutiniu metu užsiėmė mįslinga idėja, vadinamąja „trečiąja gyvybės būsena“ – kažkiek baisoku reiškiniu, kai mirusio organizmo ląstelės gali imtis naujų funkcijų po mirties. Čia kalbama apie ksenobotus³⁾ ir antrobotus, išliekančius po organizmo mirties.

Taftso un-to Masačūsetso valst. tyrėjai 2020 m. paėmė odos ląsteles iš mirusių afrikietiškų Xenopus laevis (vietine kalba, platanos) varlių embrionų ir stebėjo, kaip jie persitvarko į naują daugialąstį organizmą, kurį pavadino ksenobotu. Skirtingai nuo kitų ląstelių, tokių kaip navikai ar organoidai, kurie nesustodami dalijasi po mirties, tie ksenobotai elgėsi kitaip judėdami skysčiu. O M. Levino⁴⁾ ir kitų tyrimai taip pat nustatė tą savybę turint ir žmogaus plaučių ląsteles, iš jų sukuriant antrobotus, gebančius savarankiškai susiburti ir judėti. Jų galimybė judėti užtikrina tai, kad jų paviršius, kaip ir ksenobotų, padengtas į plaukelius panašiomis baltyminėmis ataugomis, vadinamosiomis blakstienėlėmis, kurios juda ir stumia botus skysčiu. Kad galėtų patekti kur reikia, reikia, kad blakstienėlės „plaktų“ suderintai.

Būsimos šių botų versijos gali būti panaudojamos mikroplastiko taršai vandenynuose valyti, toksiškų medžiagų lokalizavimui ir suvirškinimui, vaistų tiekimui į organizmą arba apnašų pašalinimui iš arterijų sienelių ir pan. Tačiau dėl jų kyla ir etinių problemų – o jei jie virs būtybėmis, įgaudami kažkokią psichinės veiklos formą (jei įtrauks ir nervų ląsteles ir pvz., jaus skausmą), kurių interesus reiks ginti? Ir kaip klasifikuoti tuos ksenobotus ir antrobotus – kaip gyvas būtybes ar mašinas?

Yra daugybė veiksnių, turinčių įtakos tam, kaip šios ląstelės gyvena po mirties, įskaitant laiką, praėjusį nuo mirties, infekciją, traumą ir medžiagų apykaitos aktyvumą, taip pat kitus kasdieniškesnius veiksnius, tokius kaip amžius, sveikata ir lytis. Hipotezė, kodėl taip atsitinka, vis dar nėra aišku, tačiau siūloma pagrindinė teorija.

Pagal vieną hipotezių, specializuoti kanalai ir siurbliai išorinėse ląstelių membranose yra sudėtingomis elektrinėmis grandinėmis. Jie generuoja elektrinius signalus, leidžiančius ląstelėms bendrauti tarpusavyje ir atlikti tam tikras funkcijas, kaip kad augimas ir judėjimas, formuojant organizmo struktūrą.

Tačiau tikrąja šių antrobotų viltimi yra gebėjimas juos išauginti iš gyvų audinių, kol pacientas dar gyvas. Jei pavyktų juos sukurti taip, kad jie tiksliai pristatytų reikalingus vaistus, mažai tikėtina, kad jie sukeltų imuninį atmetimą. Tokie robotai galėtų sumažinti tokių ligų kaip aterosklerozė ir cistinė fibrozė priežastis. Nors kai kurie mano, kad jų svarba pervertinta...

Vis tik (ir laimei) ši trečioji būsena nėra kažkokia nemirtingumo sfera, kurioje ląstelės gyvuoja amžinai – jos žūsta per 4-6 savaites, tad bet kokie šių botų nešami vaistai negali netyčia leisti įsitvirtinti invazinėms ląstelėms (iš esmės, nužudant pacientą), kad išgydytų ligą. Ir nors dar tik pradedama aiškintis šią „trečiąją būseną“, tačiau jau dabar aiškėja, kad gyvenimas nėra vien balta ir juoda, kaip iki šiol manyta.

Tarp gyvo ir negyvo!!!

Atrodo, kad pasakyti, kas yra gyvybė, visai nesunku. Tačiau gamtoje yra ir organizmų, metančių iššūkį jos apibrėžimui. Pvz., virusai, kurie patys neauga, savarankiškai nesidaugina ir nesigamina sau energijos – todėl juos išbraukia iš gyvybės apibrėžimų. Tačiau vos tik patekęs pas šeimininką, virusas tampa nepaprastai aktyviu ir gali būti atsakingu už pasaulio tvarkos keitimą (kaip buvo su COVID-19).

Tačiau viskas dar sudėtingiau ir skirstymas į „gyva“ ir „negyva“ gali turėti ir kitas „pilkas“ zonas – ir štai neseniai aptiktas naujas atstovas joms (kaip rašoma kanadiečių ir japonų straipsnyje. 2025 m. gegužės 2 d. patalpintame „bioRxiv“ serveryje). Toji esybė, pavadinta „Sukunaarchaeum mirabile“ (pagal japonų dievybę, pasižyminčią mažu ūgiu), turi genus, leidžiančius susikurti ribosomas ir RNR (ko neturi virusai), tačiau (kaip ir virusai), tam tikras biologines funkcijas perleidžia savo šeimininkui. Ir ji, regis, yra apsėsta replikavimusi.

Jo genomas yra stulbinančiai mažas (apie 238 tūkst. porų) – tik apie pusė archėjų genomo dydžio. Tuo tarpu virusai turi šimtais tūkstančių ar net milijonais daugiau porų.

¹⁾ Stenlis Koenas (Stanley Norman Cohen, g. 1935 m.) – amerikiečių genetikas, Stanfordo un-to profeesorius (nuo 1968 m.), Volfo premijos laureatas. Tyrinėjo bakterijų plazmidus, aiškindamasis, kaip plazmidų genai leidžia bakterijoms likti stabiliomis. Tai, derinant su P. Bergo ir H. Bojerio tyrinėjimais, atvedė prie genų jungimo ir transplantacijos metodų sukūrimo 1972 m., kas žymėjo genų inžinerijos pradžią, ir todėl jis gavo JAV Nacionalinį mokslo medalį. Taip tyrinėja daugelį sričių, tame tarpe ląstelių augimą ir vystymąsi.

²⁾ Herbertas Bojeris (Herbert Wayne "Herb" Boyer, ) - amerikiečių biochemikas, Kalifornijos un-to profesorius, „Genentech“ kompanijos įkūrėjas. Atrado rDNR, metodą, priverčiantį bakterijas gaminti svetimus baltymus, kas suteikė postūmį link genų inžinerijos. 1978 m. susintetino insuliną panaudodamas naują genetiškai modifikuotą bakteriją.

³⁾ Ksenobotai – superkompiuteriu iš įvairių biologinių audinių sukuriami sintetiniai organizmai specifinių funkcijų atlikimui. Jų plotis iki 1 mm ir jei sudaryti tik iš dviejų elementų: odos ir širdies raumens ląstelių, paimtų iš kamieninių ląstelių ankstyvoje embriono vystymosi būsenoje. Odos ląstelės sudaro tvirtą organizmo apvalkalą, o širdies ląstelėms tenka variklio vaidmuo. Jie, naudodami savus resursus, gali išgyventi kelias savaites ir net „išsigydyti“, juos pažeidus.

⁴⁾ Maiklas Levinas (Michael Levin, g. 1969 m.) - žydų iš Rusijos kilmės amerikiečių biologas Taftso un-te ir jo Nežemiečių aptikimo centro direktorius. Į JAV šeima atvyko 1978-ais. Jis žinomas kaip bvienas iš ksenobotų atradėjų. Jo laboratorija dirba su bio-elektros taikymais ląstelių valdymui, bio-informatika ir dirbtiniu intelektu, kuriant ir testuojant algoritminius modelius, jungiančius molekulinę genetiką su norfogeneze. Yra vienas žurnalo „Bioelectricity“ redaktorių.